国自然2023热点——植物小RNA高分新宠phasiRNA | 转录调控专题

植物小RNA研究目前仍然诸多高分文章的常客，尤其是一些顶级植物学期刊上，关于植物小RNA的研究近些年热度仍然是居高不下。小RNA在植物中参与调控一系列重要的生命活动，包括植株生长发育、胁迫因子应答和抵御病原菌入侵等。小RNA大家族包含microRNA （miRNA）、ta-siRNA/phasiRNA（trans-acting/phased siRNA）、nat-siRNA（natural antisense siRNA）、hc-siRNA（heterochromatic siRNA）。

这些已发表的小RNA研究，大部分仍然聚焦在miRNA上。2019年-2022年，联川生物总计协助客户发表超过110篇植物小RNA研究，每篇研究平均影响因子超过6.7分。但是绝大部分为miRNA方向，仅有2篇phasiRNA相关研究发表。

但是这2篇仅有的phasiRNA研究，一篇发表在了Nature Communications，另一篇发表在了Plant Biotechnology Journal。都属于植物学的顶级期刊。此外2022年发表的诸多小RNA研究中，phasiRNA高分文章就达到了12篇以上，包括Plant Cell、Plant Biotechnology Journal、New Phytologist等杂志。

那么这个phasiRNA究竟是何方神圣，又是如何成为高分文章收割机的？本文，小编就带你了解下phasiRNA以及国自然申请的若干注意事项。

想要依靠创新性，申请到国自然，phasiRNA绝对是利器。

1.   phasiRNA概念简介

phasiRNA全称phased small interfering RNA，即阶段性小干扰RNA。较早发现的tasiRNA是由miRNA触发非编码TAS转录物裂解产生的一类次级siRNAs，它们能以反式作用的方式抑制靶基因转录物的转录水平。

参与介导生成tasiRNA的蛋白主要包括RDR3、SGS3、DCL4、AGO1、AGO7等。但后来发现有些tasiRNA还可以对下游的转录本进行具有顺式调控作用，因此tasiRNA由更为广泛的“phased siRNA”来替代，即phasiRNA。这里的这里“phased”一词表示小RNA是从头到尾依次裂解产生的。

标准的phasiRNA和ta-siRNA实际上很容易区分，因为当phasiRNA由非编码转录物产生并在局部区域外发挥作用时，它们被称为ta-siRNA。所以上图能够非常容易帮助大家区分四类siRNA在彼此之间的包含关系。

想要在植物体内生成phasiRNA，一般有两种经典模式，即“one-hit”模式和“two-hit”模式。近些年还出现了升级版的one-hit模式，即Updated one-hit模式。

无论是one-hit还是two-hit，前期ta-siRNA和phasiRNA前体分别由植物RNA聚合酶Pol II从基因座上分别转录出编码蛋白的mRNA及非编码RNA的转录本。随后这些转录本通过THO/TREX蛋白复合物从细胞核转运至细胞质，继而被运输至AGO蛋白（Argonate）催化中心，在下一步就会成为miRNA靶向剪切的模板RNA。miRNA在切割模板RNA时，会先产生小RNA前体随后被RDR6和SGS3放大为dsRNA复合物，随后dsRNA被DCL4和DRB4加工成若干条次级siRNA，即phasiRNA。

但是one-hit和two-hit究竟有何不同呢？

如果miRNA长度为22nt或含有miRNA*的凸起结构，则符合one-hit模型，即miRNA对靶向的RNA只有单个靶向剪切位点并通过AGO1切割，然后从3’端向其靶位点方向裂解mRNA产生phasiRNAs

而two-hit模型中miRNA长度为21 nt且有针对靶向的RNA有2个靶向剪切位点，但是即便2个靶向位点都与AGO7蛋白中的miRNA互作，最终只有一个位点可以被切割。裂解仅发生在3’端位点上，即从5’端向3’端靶位点方向依次裂解产生phasiRNA。

近些年还出现了one-hit升级版，即updated one-hit模型。即使在没有切割事件的情况下，miRNA和靶序列之间的相互作用足以诱导AGO1或AGO7产生次级siRNA。

无论是one-hit还是two-hit产生的小RNA片段，随后如同前面描述的那样在RDR6和SGS3保护和扩增下，形成dsRNA。这些dsRNA随后分别被DCL1、DCL4及DCL3b蛋白处理，这些DCL家族蛋白具体功能如下所述：

① DCL4介导21nt siRNA生成，这些siRNA被AGO1蛋白复合物招募以介导靶mRNA的切割或诱导次级siRNA的生成。

② DCL1也介导21nt siRNA生成，但这些siRNA被结合到AGO4分支蛋白中，以介导其自身DNA位点的甲基化。

③ DCL3家族蛋白如DCL3b等介导24nt siRNA生成，这些siRNA可与AGO1结合以切割靶序列或与AGO4结合以进行DNA甲基化。无论是AGO1还是AGO4生成的反式活性ta-siRNA和phasiRNA是否介导DNA甲基化修饰的机制目前仍不清楚。

2.   phasiRNA的基因座进化及下游调控功能

用于产生phasiRNA的基因座称之为PHAS。植物PHAS基因座可根据其基因组来源分为两大类：在产生lncRNA的非编码区域内发现的PHAS基因座，以及位于蛋白质编码基因内的PHAS基因座。

在迄今为止在陆地植物中鉴定的所有PHAS基因座中，miR390-TAS3-ARF途径是最保守和最典型的。因此TAS3可以说是植物中最保守的lncRNA。植物中的PPR基因产生大量的phasiRNA，尤其是在真双子叶植物中。PPR phasiRNA的生成途径包括许多不同的触发miRNA。另一个相对高度保守的phasiRNA通路是miR828-TAS4-MYB模块。这种调节通路广泛存在于种子植物中，但可能在一些单子叶植物谱系中丢失。24nt长度且与生殖相关的phasiRNA通路广泛存在于真双子叶植物中。

上图所展示的是主流的phasiRNA所对应的生成模式、基因座、靶基因以及物种信息汇总。

目前phasiRNA的相关研究报道仍然不多，仍然处于未开垦的蓝海领域。根据已发表的文献来看，phasiRNA下游功能和机制研究主要集中在抗病研究、逆境胁迫、植物发育等几个主要的领域。

① 抗病研究方向

植物在进化的过程中产生了诸多能够抵御病原微生物侵染的R基因，如NLR基因等。激活这些基因座上源源不断产生phasiRNA的miRNA就显得非常重要。

案例1：豆科植物中的miR1507和miR1510，茄科物种中的miR6019和miR6027，大麦和小麦中的miR9863能够调节NLR蛋白的MLA基因继而产生大量下游的phasiRNA。

案例2：此外拟南芥中的PPR基因上的phasiRNA也参与植物免疫调节。当拟南芥被灰霉病感染时，来自TAS1c和TAS2的tasiRNA从植物宿主转运至真菌病原体内，从而诱导真菌致病基因的沉默。

② 逆境胁迫方向

案例1：拟南芥TAS1基因的miR173触发的PhasiRNA靶向参与耐热性的两个基因HTT1和HTT2。过表达TAS1促进了tasiRNA的积累，导致耐热性降低。

案例2：豆科植物miR1514a在干旱胁迫期间触发NAC700产生phasiRNA。在水分充足的条件下，NAC700TF调节参与正常代谢和生长的下游基因。然而在缺水的情况下，miR1514a抑制NAC700和NAC700衍生的phasiRNAs。

③ 生殖发育方向

已知在植物的花药中存在大量的phasiRNA，这些phasiRNA仅有极少部分的功能被解析。例如水稻的花药中发现了大量生殖相关且长度在21nt和24nt的phasiRNA及lncRNA前体基因座。miR2118用于激活21nt的phasiRNA，miR2275用于激活24nt的phasiRNA。但是这些miRNAs和phasiRNA在其他部位并未表达。这些RNA在不同单子叶植物中高度保守，所以表达上具有时空性的phasiRNA在部分单子叶植物的早期生殖发育中发挥重要作用。

上图是近些年已发表的与生殖相关的phasiRNA研究。

4.   phasiRNA基金申请要素点

批准年度	标书题目	申请单位	获批金额
2022	玉米雄性生殖细胞中phasiRNA稳态调控机制的研究	安徽农业大学	30万
2022	茶树响应轮斑病侵染的phasiRNA鉴定及其对病害防御的分子机制	安徽农业大学	30万
2021	水稻生殖24-nt phasiRNA的作用机制和功能	清华大学	30万
2021	小麦雄蕊发育相关phasiRNA合成路径中关键基因的功能解析	山东农业大学	58万

已知在2021-2022年获批的诸多植物小RNA国自然基金标书中，其中有2个方向是前文中提及的：生殖发育与病原微生物抗性研究。所以作物学、果树学、园艺学、植物保护病理方向、植物生理学等方向研究的老师，可以多多关注phasiRNA，在创新性上优于传统的miRNA研究。

在选材上，病毒、真菌、细菌等侵染的部位，抗旱抗寒以及重金属胁迫的根部和叶片，花（花萼、花冠、雄蕊和雌蕊），果实，种子可以优先考虑。

锁定材料后，在实验设计上既可以遵循经典比较组vs处理组的原则，也可以在不同时间段处理的维度上进行关注。

拿到感兴趣的预实验材料后，可采用转录组测序+小RNA测序+降解组测序的方式，初步锁定差异的分子。转录组中优先关注一些与生殖发育、抗病抗旱胁迫相关的基因和转录因子家族，小RNA和phasiRNA可以优先关注已发表的文献中报道的小RNA家族以及差异特别明显的miRNA和phasiRNA，继而与降解组数据进行联合，会使得标书申请显得更加扎实。

所以前期用多少样本，需要几个比较组，涉及到几个组学技术，这边小编仅仅给出几个方案为大家参考：

01方案一

测序组合：转录组测序、miRNA测序、降解组测序

分组方案：实验对照组vs样品处理组，总计2组

重复数量：转录组测序和miRNA测序，每组6个生物学重复。降解组测序，6个样本混合成一个样本测序

02方案二

测序组合：转录组测序、miRNA测序

分组方案：实验对照组1组，不同时间段处理组3-5组

重复数量：转录组测序和miRNA测序，每组6个生物学重复。

 

最后也是祝愿各位老师基金标书能够高中！

参考文献

1.Liu Y., et al. (2020) PhasiRNAs in Plants: Their Biogenesis, Genic Sources, and Roles in Stress Responses, Development, and Reproduction. Plant Cell, 32(10):3059

2.Deng P., et al. (2018) Biogenesis and regulatory hierarchy of phased small interfering RNAs in plants. Plant Biotechnology Journal, 16(5):965

相关阅读

击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由